1　范圍

本標準規(guī)定了微生物肥料實驗室使用的培養(yǎng)基技術(shù)要求。

本標準適用于微生物肥料產(chǎn)品質(zhì)量檢驗、菌種培養(yǎng)與保藏用培養(yǎng)基的制備。

2　規(guī)范性引用文件

下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。

GB/T 19524.1-2004   肥料中糞大腸菌群的測定

NY 527-2002         光合細菌菌劑

3　術(shù)語和定義

培養(yǎng)基 medium

由人工配制的適合微生物生長、代謝、繁殖和保存的營養(yǎng)基質(zhì)。

4　培養(yǎng)基制備流程圖（略）

5　培養(yǎng)基選用原則

5.1　含有滿足所培養(yǎng)的微生物生長必需的營養(yǎng)物質(zhì)。

5.2　各種營養(yǎng)物質(zhì)要有合適的比例和濃度?！?br/>
5.3　有合適的pH范圍和一定的緩沖pH能力。

5.4　有一定的氧化還原電位和合適的滲透壓。

5.5　對于特殊用途的培養(yǎng)基，除遵循以上原則外，還應(yīng)滿足以下要求：

5.5.1　在選擇培養(yǎng)基中，應(yīng)加入利于目的微生物生長而抑制其它微生物生長的化學物質(zhì)。

5.5.2　菌種保藏培養(yǎng)基選用原則

5.5.2.1　對于產(chǎn)芽孢或孢子的菌種保藏培養(yǎng)基應(yīng)以易產(chǎn)生芽孢或孢子為原則。

5.5.2.2　對于自養(yǎng)微生物的菌種保藏培養(yǎng)基應(yīng)只使用無機鹽類，不使用有機物。

5.5.2.3　對能利用無機氮源的微生物，其菌種保藏培養(yǎng)基中不宜使用有機氮源。

5.5.2.4　對營養(yǎng)缺陷型微生物，其菌種保藏培養(yǎng)基中必須含有該缺陷所需的物質(zhì)。

5.5.2.5　對耐某種藥物的微生物，其菌種保藏培養(yǎng)基中應(yīng)含有一定濃度的該種藥物。

6　要求

6.1　材料

6.1.1　用于配制培養(yǎng)基的化學試劑純度至少為化學純。

6.1.2　試劑出現(xiàn)顏色改變、沉淀、混濁、吸潮結(jié)塊的現(xiàn)象時，不宜使用。

6.1.3　天然原材料應(yīng)質(zhì)量穩(wěn)定，未發(fā)生霉變、生蟲和變質(zhì)。

6.1.4　瓊脂凝固后應(yīng)具有良好的透明度。

6.2　器皿

6.2.1　配制試劑所用的器皿應(yīng)潔凈。

6.2.2　盛裝培養(yǎng)基的器皿應(yīng)由對微生物無毒害并耐高溫的材料制成。

6.2.3　材料需加熱溶解時，可選用玻璃容器、搪瓷缸和不銹鋼容器等，禁用銅制、鋁制和鐵制容器。

6.3　棉塞或硅膠塞

6.3.1　不應(yīng)使用脫脂棉制作棉塞。

6.3.2　使用棉塞或硅膠塞時，將其長度的2/3塞入容器內(nèi)。要求松緊適當，緊貼管壁。

6.3.3　滅菌時，棉塞外要加包牛皮紙或耐高溫透氣塑料薄膜，以防止滅菌時棉塞受潮或進水。

6.4　培養(yǎng)基配制

6.4.1　材料稱量

6.4.1.1　根據(jù)培養(yǎng)基配方，準確稱取相應(yīng)材料的量。

6.4.1.2　當配方中某種成分微量時，可預(yù)先將該成分配制成一定濃度的母液，然后按量加入。母液須低溫保存。

6.4.2　材料溶解

6.4.2.1　不溶于水的組分應(yīng)在所需的溶劑中溶解后，再加入到培養(yǎng)基中。

6.4.2.2　非溶性組分，如CaCO3,應(yīng)最后加入。

6.4.2.3　易形成沉淀的組分應(yīng)分別溶解。

6.4.2.4　不易溶解的組分應(yīng)做預(yù)處理。加熱溶解過程中一旦出現(xiàn)焦化現(xiàn)象時應(yīng)棄用。

6.4.2.5　培養(yǎng)基中含有指示劑或有顏色的試劑時，應(yīng)在培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)好之后再加入。

6.4.3　pH測定與調(diào)節(jié)

6.4.3.1　用精密pH試紙或酸度計測定培養(yǎng)基的pH。

6.4.3.2　培養(yǎng)基的pH用稀酸或稀堿溶液調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)過程中不可用酸堿溶液反復(fù)調(diào)節(jié)。

6.4.4　分裝

裝入三角瓶的培養(yǎng)基體積不應(yīng)超過其容量的1/2，裝入試管的培養(yǎng)基體積為其容量的1/4～1/5。分裝過程中防止培養(yǎng)基粘附在瓶口或管口。

6.4.5　滅菌

6.4.5.1　高壓蒸汽滅菌

高壓蒸汽滅菌控制的條件為121℃、維持30min。當培養(yǎng)基中含有不耐高溫的組分時，可采用115℃、維持15min～30min。

6.4.5.2　過濾除菌

在無菌條件下，將待除菌溶液經(jīng)濾膜為φ≦0.2μm的細菌過濾器，達到除菌的目的。適用于易受高溫破壞、失活的物質(zhì)的滅菌，如維生素。

6.4.5.3　干熱滅菌

將待滅菌的器皿，用紙包好或放在特定的容器內(nèi)，置于烘箱中，在160℃左右保持2h。適用于培養(yǎng)皿等玻璃器皿的滅菌。

6.4.6　平板和斜面的制備

在無菌條件下把冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，平板厚度范圍控制在3mm～5mm。制備的斜面長度不超過試管長度的2/5。

6.5　培養(yǎng)基合格檢驗

6.5.1　檢查固體培養(yǎng)基濕度。培養(yǎng)基冷凝水過多或干燥出現(xiàn)裂痕時，均不能使用。

6.5.2　隨機抽取已滅過菌的培養(yǎng)基放入28℃～30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h～48h，確定無菌生長后方可使用。

6.6　培養(yǎng)基存放

培養(yǎng)基應(yīng)放在冰箱4℃-～8℃保存。經(jīng)過存放的培養(yǎng)基使用前應(yīng)進行6.5的合格檢驗，合格后方可使用。

7　微生物肥料常用培養(yǎng)基配方、配制要點和用途

微生物肥料常用培養(yǎng)基配方、配制要點和用途參見附錄A。


　

附　錄　A
（規(guī)范性附錄）
　常用培養(yǎng)基配方

A.1　營養(yǎng)瓊脂

A.1.1　成分

蛋白胨                                      10.0 g

牛肉膏                                      3.0 g

氯化鈉(NaCl)                                5.0 g

瓊脂                                        18.0 g

蒸餾水                                      1 000 mL

pH                                          7.2～7.5

A.1.2　配制要點

將各種成分溶解于蒸餾水內(nèi)，調(diào)節(jié)pH，再加瓊脂，加熱溶化后分裝。121℃高壓滅菌30min。

A.1.3　用途

適用于一般細菌培養(yǎng)和保藏。

A.2　芽孢桿菌培養(yǎng)基

A.2.1　成分

蛋白胨                                      5.0 g

牛肉膏                                      3.0 g

土壤浸出液                                  250 mL

蒸餾水                                      750mL

瓊脂                                        18. 0 g

A.2.2　配制要點

土壤浸取液：土壤50g，加水200mL，121℃滅菌1h，過濾補水至250mL。

其他同A.1.2

A.2.3　用途

適用于芽孢桿菌的保藏。

A.3　阿須貝氏（Ashby）培養(yǎng)基

A.3.1　成分

磷酸二氫鉀(KH2PO4)                           0.2 g

硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                          0.2 g

氯化鈉(NaCl)                                0.2 g

碳酸鈣(CaCO3)                               5.0 g

甘露醇(C6H14O6)                               10.0 g

硫酸鈣(CaSO4·2H2O)                　　　    0.1 g

瓊脂                                        18.0 g

蒸餾水                                      1 000 mL

pH                                          6.8～7.0

A.3.2　配制要點

同A.1.2

A.3.3　用途

用于固氮菌的培養(yǎng)。

A.4　根瘤菌培養(yǎng)基YM

A.4.1　成分

磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)                     0.5 g

硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                          0.2 g

氯化鈉(NaCl)                                0.1 g

甘露醇(C6H14O6)                               10.0 g

酵母膏                                      1.0 g

0.5%剛果紅溶液                              5 mL

瓊脂                                        18.0 g

蒸餾水                                      1 000 mL

pH                                          6.8～7.0

A.4.2　配制要點

將各種營養(yǎng)成分溶解于蒸餾水內(nèi)，調(diào)節(jié)pH后，加入剛果紅溶液。再加瓊脂，加熱溶化后分裝。121℃高壓滅菌30min。

A.4.3　用途

適用于根瘤菌的培養(yǎng)。

A.5　根瘤菌培養(yǎng)基 = 2 \* ROMAN II

A.5.1　成分

酵母粉                                      1.0 g

甘露醇(C6H14O6)                               10.0 g

土壤浸出液                                  200 mL

瓊脂                                        15.0 g

蒸餾水                                      800 mL

pH                                          7.2

A.5.2　配制要點

土壤浸出液：土壤50g，加水200mL，121℃滅菌1h，過濾補水至200mL。

其他同A.1.2

A.5.3　用途

適用于根瘤菌的保藏和培養(yǎng)。

A.6　硅酸鹽細菌培養(yǎng)基

A.6.1　成分

蔗糖（C12H22O11）                              5.0 g

磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)                   2.0 g

硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                          0.5 g

碳酸鈣(CaCO3)                               0.1 g

三氯化鐵(FeCl3·6H2O)                        0.005 g

瓊脂                                        18.0 g

蒸餾水                                      1 000 mL

pH                                          7.5～8.0

A.6.2　配制要點

先將三氯化鐵配制成5‰的溶液，按量加入，其他同A.1.2

A.6.3　用途

適用于硅酸鹽細菌的培養(yǎng)。

A.7　固氮（莖瘤）根瘤菌培養(yǎng)基

A.7.1　成分

乳酸鈉（C3H5O3Na）                           10.0 g

磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)                     1.67 g

磷酸二氫鉀(KH2PO4)                           0.87 g

氯化鈉(NaCl)                                0.05 g

氯化鈣(CaCl2)                               0.04 g

三氯化鐵(FeCl3·6H2O)                        0.004 g

硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                          0.1 g

酵母膏                                      1.0 g

瓊脂                                        18.0g

蒸餾水                                      1 000 mL

pH                                          6.8～7.0

A.7.2　配制要點

先將三氯化鐵配制成4‰的溶液按量加入，其他同A.1.2。

A.7.3　用途

適用于莖瘤根瘤菌的培養(yǎng)。

A.8　馬丁培養(yǎng)基

A.8.1　成分

磷酸二氫鉀(KH2PO4)                           1.0 g

葡萄糖(C6H12O6·H2O)                          10.0 g

硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                          0.5 g

蛋白胨                                      5.0 g

1%孟加拉紅水溶液                            3.3 mL

氯霉素                                      0.1 g

瓊脂                                        18.0 g

蒸餾水                                      1 000 mL

A.8.2　配制要點

將營養(yǎng)成分用蒸餾水溶解后，按量加入1%孟加拉紅水溶液，氯霉素先用少量乙醇溶解后加到培養(yǎng)基中。再加瓊脂，加熱溶化后分裝。115℃高壓滅菌20min。

A.8.3　用途

適用于真菌的培養(yǎng)。

A.9　高氏合成一號瓊脂

A.9.1　成分

硝酸鉀(KNO3)                                1.0 g

磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)                     0.5 g

硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                          0.5 g

氯化鈉(NaCl)                                0.5 g

硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)                        0.01 g

可溶性淀粉(C6H10O5)n                          20.0 g

重鉻酸鉀（K2Cr2O7）                          0.1 g

瓊脂                                        18.0 g

蒸餾水                                  　　1 000 mL

pH                                          7.2～7.4

A.9.2　配制要點

淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀,加熱溶解后加入。再加瓊脂，加熱溶化后分裝，121℃高壓滅菌30min。重鉻酸鉀配制成溶液單獨滅菌，使用時再加入到培養(yǎng)基中。

A.9.3　用途

適用于放線菌的培養(yǎng)。

A.10　聯(lián)合固氮菌培養(yǎng)基

A.10.1　成分

D-葡萄糖酸鈉(C6H10NaO7)                       5.0 g

磷酸二氫鉀(KH2PO4)                           0.4 g

磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)                     0.1 g

硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                          0.2 g

酵母膏                                      1.0 g

氯化鈉(NaCl)                                0.1 g

氯化鈣(CaCl2)                               0.02 g

三氯化鐵(FeCl3·6H2O)                        0.01 g

鉬酸鈉（Na2MoO4）                            0.002 g

瓊脂                                        18.0 g

蒸餾水                                      1 000 mL

pH                                          6.8～7.0

A.10.2　配制要點

將氯化鈣配、鉬酸鈉分別配制成2‰的溶液，按量加入，其他同A.1.2。

A.10.3　用途

適用于固氮螺菌的培養(yǎng)。

A.11　馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基

A.11.1　成分

馬鈴薯                                      200 g

葡萄糖(C6H12O6·H2O)                          20.0 g

瓊脂                                        18.0 g

蒸餾水                                      1 000 mL

A.11.2　配制要點

稱取去皮馬鈴薯200g切塊，放入水中煮沸30min，然后用雙層紗布過濾取汁，再加葡萄糖和瓊脂，溶化后補足水至1000mL，115℃滅菌20min。

A.11.3　用途

適用于酵母菌的培養(yǎng)。

A.12　麥芽汁瓊脂

A.12.1　成分

12波林麥芽汁（Brix）                        1 000 mL

瓊脂                                       18.0 g

pH                                          5.4

A.12.2　配制要點

將麥芽汁調(diào)至12波林的糖度，調(diào)節(jié)pH，加入瓊脂，加熱溶化后分裝。115℃高壓滅菌20min。

A.12.3　用途

適用于酵母菌的培養(yǎng)和保藏。

A.13　乳酸細菌培養(yǎng)基（MRS）

A.13.1　成分

蛋白胨                                      10.0 g

牛肉膏                                      10.0 g

酵母膏                                      5.0 g

檸檬酸氫二銨[(NH4)2C6H6O7]                        2.0 g

葡萄糖(C6H12O6·H2O)                          20.0 g

吐溫80                                      1.0 g

乙酸鈉（CH3COONa·3H2O）                     5.0 g

磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)                     2.0 g

硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                          0.58 g

硫酸錳(MnSO4·H2O)     &nb, sp                     0.25 g

瓊脂                                        18.0 g

蒸餾水                                      1 000 mL

pH                                          6.2～6.6

A.13.2　配制要點

將各種成分溶解于蒸餾水內(nèi)，調(diào)節(jié)pH，再加瓊脂，加熱溶化后分裝。121℃高壓滅菌20min。

A.13.3　用途

適用于乳酸菌的培養(yǎng)。

A.14　光合細菌培養(yǎng)基 = 1 \* ROMAN I

A.14.1　成分

酵母粉                                      3.0 g

蛋白胨                                      3.0 g

硫酸鎂(MgSO4·7H2O)                          0.5 g

氯化鈣（CaCl2）                             0.3 g

蒸餾水                                      1 000 mL

pH                                          6.8～7.0

A.14.2　配制要點

同A.1.2。

A.14.3　用途

適用于光合細菌的培養(yǎng)。

 

A.15　光合細菌培養(yǎng)基 = 2 \* ROMAN II

A.15.1　成分；

溶液 = 1 \* ROMAN I

氯化鈣（CaCl2）                             75 mg

乙酸鈉（CH3COONa）                          1.6 g

煙酸                                        40 mg

氯化鈉(NaCl)                                1.5 g

生物素                                      40 mg

酵母膏                                      2.0 g

硫胺素                                      40 mg

氯化鎂(MgCl2)                               200 mg

乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Fe）溶液               5 mL

微量元素溶液                                1 mL

蒸餾水                                      800mL

溶液 = 2 \* ROMAN II

磷酸二氫鉀(KH2PO4)                           600 mg

磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)                     1.18 g

蒸餾水                                      200 mL

將溶液 = 1 \* ROMAN I、溶液 = 2 \* ROMAN II分別于121℃高壓滅菌15min，冷卻后將溶液 = 1 \* ROMAN I、溶液 = 2 \* ROMAN II混勻。

微量元素溶液：

乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2Na2O8·2H2O）        2.0 g

硼酸（H3BO3）                                100 mg

氯化鋅（ZnCl2）                             100 mg

高鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）                    20 mg

氯化銅（CuCl2）                             10 mg

硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)                        2.0 g

氯化鈷（CoCl2·6H2O）                        100 mg

氯化錳（MnCl2·4H2O）                        100 mg

氯化鎳（NiCl2·6H2O）                        20 mg

亞硒酸鈉（Na2SeO3）                                             1 mg

蒸餾水                                      1 000 mL

乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Fe）溶液:

乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Na2）                  20.0 g

硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)                        20.0 g

蒸餾水                                      1 000 mL

A.15.2　配制要點

乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Fe）溶液需要通氣過夜，維生素類物質(zhì)要過濾除菌后按量加入到培養(yǎng)基中。。

A.15.3　用途

適用于光合細菌的培養(yǎng)。

A.16　乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基(用于大腸菌群初步發(fā)酵)

A.16.1　成分

蛋白胨                                      20.0 g

    豬膽鹽                                      5.0 g

    乳糖                                        10.0 g

0.04%溴甲酚紫溶液                           25.0 mL

    蒸餾水                                      1 000 mL

    pH                                          7.2～7.4

A.16.2　配制要點

將各種成分溶解于蒸餾水內(nèi)，調(diào)節(jié)pH，然后加入溴甲酚紫溶液，分裝到試管中，并放入小倒管。115℃高壓滅菌15min。

A.16.3　用途

用于乳糖發(fā)酵實驗。

A.17　伊紅美藍瓊脂

A.17.1　成分

蛋白胨                                      10.0 g

    乳糖     &